光合成細菌 RAP99 の自然免疫系試験(in vivo,in vitro)

【目的】

RAP99-LPSによる、マウスの脾臓を用いた免疫細胞の活性化を確認する。

【試験方法】

マウスにRAP99-LPSを8日間接種（静脈注射）し、脾臓での免疫細胞数の変化を確認した。

【結果・考察】

RAP99-LPSを投与したところ、樹状細胞^*1やマクロファージ^*2、NK細胞^*3など自然免疫系^*4の免疫細胞と、活性化ヘルパーT細胞^*5や活性化キラーT細胞^*6などの獲得免疫系^*7の免疫細胞数の増加が認められた。

図1 マウスの脾臓の免疫細胞の活性化

<用語解説>

＊1 樹状細胞：樹の枝のような突起を多数もつ免疫細胞であり、自然免疫系に属する。体内に侵入した異物を認識、貪食、分解して得られたペプチドをMHC分子上に提示して当該ペプチドを認識するT細胞を活性化する。活性化によって大量のサイトカインを放出する。体の全ての部位に存在し、異物を貪食してリンパ節、脾臓などに移動してT細胞に抗原を提示する。

＊2 マクロファージ：マクロファージは自然免疫系に属する。体内に侵入した異物を貪食し、消化・排出し、感染拡大を防ぐ。

＊3 NK細胞：ナチュラルキラー細胞はリンパ球様の形態をした自然免疫系の細胞。ウイルス感染、がん化によって細胞表面のMHC分子が減少する場合があるが、それを感知して当該細胞にアポトーシスを引き起こして排除する。

＊4 自然免疫：ウイルス・細菌などの異物が身体に侵入した時に、哺乳類とは異なる形の物質のパターンを認識して反応する免疫細胞（マクロファージ、樹状細胞、NK細胞など）が関与する免疫反応。獲得免疫の活性化に必須で獲得免疫よりも先行して反応する。

＊5 活性化ヘルパーT細胞：免疫細胞の中の指揮者に例えられる重要なT細胞。特異的なマーカーはCD4分子である。樹状細胞のMHCクラスII分子にて抗原提示を受け活性化するがその時、大量のサイトカインなどの可溶性分子を放出して周囲の免疫細胞の反応性を制御する。抗原提示時に周囲に存在するサイトカインにて自身が産生するサイトカインが決まる。それぞれIFNg、IL-4、IL-17を産生するTh1、Th2、Th17細胞などがある。

＊6 活性化キラーT細胞：ウイルス感染細胞、がん化細胞に直接アポトーシスなどの細胞死を誘導するT細胞。特異的なマーカーはCD8分子である。樹状細胞のMHCクラスI分子にて抗原提示を受け活性化する。体内でのウイルス感染細胞、がん化細胞を含む異物の存在を監視する細胞で正常な活性化に活性化ヘルパーT細胞を必要とする。

【目的】

RAP99-LPSによる、合成二本鎖RNA（poly(I:C)）を用いたマウスの模擬ウイルスに対する免疫応答作用を確認する。

【試験方法】

予めRAP99-LPSを毎日5回、5日間マウスに接種し、6日目に模擬ウイルス（poly(I:C)）^*1を接種した。血清中の炎症性サイトカイン^*2の産生量を調べ、さらに脾臓中での炎症誘導機構（IL-6アンプ）^*3の活性化を解析した。

【結果・考察】

マウスにRAP99-LPSを投与することで、免疫細胞の遊走を促進するpoly(I:C)依存性のケモカイン発現が維持されたまま、免疫反応の暴走の原因である炎症性サイトカイン発現と脾臓でのIL-6アンプ活性化が抑制された。

図1 マウス血清中のケモカイン

図2 マウス血清中の炎症性サイトカイン

図3 マウス脾細胞中のIL-6アンプ活性化因子の発現

以上の結果より、RAP99-LPSは、免疫細胞の暴走の原因である炎症性サイトカイン発現の抑制、さらに脾臓でのIL-6アンプ活性化の抑制効果があると考えられる。

<用語解説>

*1 poly(I:C)：ポリイノシン酸:ポリシチジル酸の略であり、新型コロナウイルスなどのRNAウイルス感染を模倣する。二本鎖RNAの合成類似体であり、TLR3分子にて認識される。

*2 炎症性サイトカイン：サイトカインは、もともと免疫細胞間の情報伝達を行い、免疫細胞の活性化状態を変化させる可溶性の分子として定義された。炎症性サイトカインは、それらの中で免疫細胞を活性化させるものでIL-6をはじめ，IL-1b, IL-8, TNFaなどがある。

*3 IL-6アンプ： 血管内皮細胞や線維芽細胞など非免疫細胞が活性化された免疫細胞が産生するサイトカインを受け取ると転写因子であるSTAT3とNFκBなどの活性化が生じる。IL-6アンプは2008年に発見されたコンセプトで非免疫細胞にてSTAT3とNFκBが同時に活性化された場合に非常に強いNFκBが生じてNFκB の標的分子であるIL-6、ケモカイン（遊走因子）、増殖因子などが局所産生され炎症が拡大する分子機構。炎症時のSTAT3活性化因子がIL-6が主体であるためにこの名がある。

マクロファージとは

結果・考察

光合成細菌RAP99を加えることによって NO量 が増加。これはマクロファージが光合成細菌RAP99によって活性化されたことを示しており、生体防御機能も高まるのではないかと推察される。

【試験責任者：東北薬科大学（現：東北医科薬科大学）教授 石川正明】

NK細胞とは

結果・考察

光合成細菌RAP99によってNK細胞の活性が上昇。

標的となるYAC-1細胞に対し、NK細胞を含んでいる脾臓の割合を1：50として混合した試料において、特に細胞障害活性が対照と比較して1.7倍増加。

光合成細菌RAP99のがん細胞増殖抑制効果が、免疫細胞の活性化によるものである可能性が考えられた。

【試験責任者：東北薬科大学（現：東北医科薬科大学）教授 石川正明】

サイトカインとは

結果・考察

光合成細菌RAP99を加えることによって、サイトカインTNF－αが増加。これにより、免疫細胞が活性化されることが推察される。

【試験責任者：東北薬科大学（現：東北医科薬科大学）教授 石川正明】

TLRとは

TLRは、トル様受容体（Toll Like Receptor）といい、細菌やウイルスなどの外敵の侵入を感知するセンサーの働きをしている。自然免疫系の細胞が持っており、ヒトでは現在10種類（TLR1～TLR10）が確認されている。それぞれが異なる病原体を認識して活性化し、獲得免疫へと誘導される。

試験の目的

光合成細菌RAP99（以下RAP99）およびRAP99由来LPS（以下RAP99-LPS）によるTLRの活性化について、HEK293細胞^※1を用いて明らかにする。

※1：ヒト胎児の腎臓由来の細胞株のこと。

これにTLR遺伝子を導入させたものを試験に用いた。TLRが活性化されるとIL-8^※2が産生されるように設計されている。

※2：細胞間の相互作用に関与する物質であり、自然免疫系の重要な役割を担っている。

試験結果

各TLR遺伝子を導入したHEK細胞（①TLR導入なし、②TLR4、③TLR2、④TLR9、⑤TLR4/MD2/CD14^※3）を用いてTLR活性試験を行った。TLRが活性化されるとIL-8が産生されるため、IL-8の濃度が高いほどTLRが活性化されていることを示す。

陰性対照物質は培養液（medium）、陽性対照物質は乳酸菌死菌、または小麦やサツマイモなどの植物と共生している細菌より精製したLPS（以下、LPSp）を用いた。結果を以下に示す。

※3：TLR4にMD2やCD14といった補助因子を結合させたもの。

TLR4は単体で用いるよりも、MD2やCD14と結合することで機能を発揮するといわれている。よって、TLR4活性試験はTLR4単体と、TLR4にMD2およびCD14を結合したTLR4/MD2/CD14の2種類を行った。