光合成細菌 RAP99 の抗炎症系試験(in vivo,in vitro)

抗炎症系試験

PPARγ経路活性化によるサイトカイン産生抑制評価試験

目的

RAP99-LPSのTHP-1細胞を用いた15d-PGJ2を介するPPARγ経路活性化によるサイトカイン産生抑制効果を明らかにする。

結果

ヒト単球由来の細胞株THP-1を用いて、RAP99-LPSの炎症性サイトカイン(TNF-αとIL-6)の誘導作用を確認した。また、核内受容体PPAR-γのアンタゴニストであるGW9662を用いて、RAP99-LPSの炎症性サイトカインの誘導作用への関与についても確認した。結果を図1、2に示す。また、図中のグラフはn=3の平均値と標準偏差を示す。

図1. TNF-α濃度測定

図1より、TNF-α濃度はRAP99-LPSの用量依存的に低下した。また、GW9662(+)はGW9662(-)に比べてやや低いTNF-α濃度を示した。

図2. IL-6濃度測定(対数表示)

図2より、IL-6濃度はRAP99-LPSの用量依存的に低下した。また、GW9662(+)はGW9662(-)に比べて高いIL-6濃度を示した。

考察

以上の結果から、RAP99-LPSは炎症性サイトカインのTNF-α及びIL-6の産生量を用量依存的に抑制したが、PPAR-γの機能をGW9662で封じた場合には、TNF-αの産生抑制作用には影響が現れなかったが、IL-6の場合は影響が現れ、産生量抑制作用が低下した。このことから、RAP99-LPSのIL-6の産生抑制には、PPAR-γが関与していることが示唆される。

【試験責任者:自然免疫応用技研株式会社】

酢酸ライジング法による鎮痛効果試験

疼痛とは

RAP99投与によるライジング数の変化

疼くようなカラダの痛みのこと。

がんなどの重症疾患では激しい疼痛を伴う場合があり、これによりQOL(生活の質)を著しく低下させることにもつながる。

本試験では「酢酸ライジング(acetic acid writhing test)」という方法を用い、マウスに光合成細菌RAP99を投与した時の鎮痛効果を測定した。

酢酸ライジング試験とは

ライジング症状例

マウスに酢酸を投与すると、痛みにより特有の“身もだえるような症状(ライジング)”が現れる。

光合成細菌RAP99投与前と投与後で、その回数を比較し、痛みに対する抑制効果を試験する。

結果・考察

光合成細菌RAP99を投与することにより、ライジング(身もだえ)回数が45.3%減少した。このことから、光合成細菌RAP99には痛みを抑制する効果があると推察される。

【試験責任者:東北薬科大学(現:東北医科薬科大学)教授 石川正明】

ラットを用いたアジュバント関節炎モデル(AIA)試験

アジュバント関節炎モデル

RAP99を経口投与する事により抗炎症剤と同様の効果が得られた。

光合成細菌RAP99を用いた浮腫容積の比較試験

数日にわたる慢性炎症のモデル。

結核死菌を用いた完全アジュバントを感受性の高いラットの足うらに投与し、四肢に関節炎を誘発させるモデルである。

関節部位の腫張や疼痛、関節軟骨の破壊などの症状が、ヒトの関節リウマチに類似しており、抗リウマチ薬や抗炎症薬などの評価に用いる。

結果・考察

マウス関節の浮腫面積(mL)が無処置に対して、インドメタシンと同様に炎症抑制効果が認められた。

3日目では、顕著な変化は認められなかったが、17日目と21日目の観察で浮腫面積が無処置に比べて半分程度となり、インドメタシンに匹敵する浮腫容積の増大抑制作用が認められた。この結果より、光合成細菌RAP99が抗炎症剤である、インドメタシンと同等の抗炎症作用をもたらすことが考えられる。

【試験責任者:東北薬科大学(現:東北医科薬科大学)教授 石川正明】

マウスを用いたデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)誘発大腸炎抑制試験

大腸炎とは

大腸炎とは、大腸の最も内側の粘膜に炎症が起こり、びらんや潰瘍ができる大腸の炎症性疾患で、難病に指定されている。

発症年齢は20代に多くみられるが、若年者から高齢者まで発症する。

DSS誘発性炎症性腸疾患モデル試験とは

デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)を含む水をマウスに飲ませることにより腸炎を発生させる。そのマウスを用いて、様々な試験を実施する。これによって腸炎を発生したマウスは、炎症性腸疾患と類似の症状を引き起こすと考えられる。

本試験では、DSSを用いて大腸炎を発生させたマウスに光合成細菌RAP99を投与し、炎症度合を評価した。

試験方法

マウスに光合成細菌RAP99菌体を0.1%含有する飼育用飼料を摂取させた。4週間後から5%-DSSを自由摂取させ、大腸炎を発生させた。

この間も0.1%光合成細菌RAP99含有飼料を与え、8日後に結腸部を摘出し、ホルマリン液で固定した。

※再生上皮とは粘膜が脱落したところに新しく出来た表皮(上皮)のこと。

結果・考察

図より光合成細菌RAP99を摂取したマウスは、潰瘍の縮小および再生上皮の拡大が認められた。

よって、光合成細菌RAP99は大腸炎の炎症を抑える働きがあると考えられる。

【試験責任者:東北薬科大学(現:東北医科薬科大学)教授 石川正明】

卵白アルブミン誘発アレルギー試験を用いたTh1/Th2インバランス是正確認試験

目的

卵アルブミン(卵白を構成するタンパク質)によるアレルギー反応を起こしたマウスに、光合成細菌RAP99を経口投与し、Th1/Th2のバランスに与える影響を評価することを目的とした。

Th1/Th2とは?

Th1,Th2イメージ

Th1、Th2ともに免疫細胞であるT細胞のこと。

体内に侵入した異物の種類によってTh1またはTh2に変化する。Th1は主に細菌やウイルスに対して反応する細胞であり、Th2は主に花粉やアレルギー物質に対して反応する細胞のことである。

これらのバランスが崩れ、Th2が過剰に存在すると、アレルギー症状が出るといわれている。

試験方法

①血清中のIgE※1およびIL-4※2測定

マウスにRAP99菌体を2週間摂取させ、最終日に卵アルブミンを投与した。さらに10日後に卵アルブミンを追加投与し、その1週間後に採血した。採血した血清を用いてIgEおよびIL-4測定を行った。比較として、RAP99菌体を摂取していないマウスも同様に試験を行った。

※1:IgEとは、身体の中に入ってきたアレルギー物質に対して反応する抗体のこと。アレルギー体質の方は血液中に多くのIgEが存在すると言われている。したがって、IgE値が低くなるとアレルギー体質の改善につながる。

※2:IL-4とは、身体の中にアレルギー物質が侵入したことを全身に伝える物質のこと。まずTh2からIL-4が分泌される。このIL-4が細胞に働きかけ、IgEの産出を促すことになる。

②脾臓※3細胞中のIFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5※4測定

マウスにRAP99菌体を2週間摂取させ、最終日に卵アルブミンを投与した。さらに10日後に卵アルブミンを追加投与し、その1週間後に脾臓を採取した。採取した脾臓を用いてIFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5測定を行った。比較として、RAP99菌体を摂取していないマウスも同様に試験を行った。

※3:ヒトの脾臓は、胃の左側の肋骨の下にある臓器。全身のリンパ球の4分の1が集まっており、「免疫機能の要」とも言われている。

 

※4:IFN-γ及びIL-2は、Th1から産出される細胞のことで、免疫の調節機能を持っている。IL-4及びIL-5は、Th2から産出される細胞のことで、アレルギー反応に影響している。

 

試験結果

①血清中のIgEおよびIL-4測定結果

図1、2に血清中のIgEおよびIL-4量の測定結果を示す。光合成細菌RAP99菌体を摂取したマウスでは、未摂取のマウスに比べてIgEおよびIL-4量が減少した。

図1 マウス血清中のIgE量

図2 マウス血清中のIL-4量

②脾臓細胞中のIFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5測定結果

図3~6に、マウスの脾臓細胞中のIFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5量の測定結果を示す。光合成細菌RAP99菌体を摂取したマウスでは、未摂取のマウスに比べてTh1型のIFN-γ及びIL-2量が増加し、Th2型のIL-4及びIL-5量が減少した。

図3 マウス脾臓細胞中のIFN-γ量

図4 マウス脾臓細胞中のIL-2量

図5 マウス脾臓細胞中のIL-4量

図6 マウス脾臓細胞中のIL-5量

 

考察

アレルギー反応はTh2が過剰に存在することで引き起こされる。試験結果より、Th2型のIgE及びIL-4、IL-5量が減少し、Th1型のIFN-γ及びIL-2量が増加したことから、Th1とTh2のバランスが良くなり、アレルギー反応の改善に繋がると考えられる。

【試験責任者:東北薬科大学(現:東北医科薬科大学)教授 石川正明】

マウスを用いたヒスタミン遊離量の評価

目的

体内でアレルギー反応を引き起こす物質のひとつであるヒスタミンについて、光合成細菌RAP99菌体の摂取による影響をアレルギー試験によって評価することを目的とした。

方法

表1.群分け

マウスを以下の通りに群分けした。

A)対照群

雌性マウス13匹を用いた。対照群では光合成細菌RAP99菌体、卵アルブミン/水酸化アルミニウムゲル(以下アレルギー物質)は投与していない。最終日に採血し、血清中のヒスタミン量を測定した。

B)光合成細菌RAP99菌体の投与無群

雌性マウス15匹を用いた。最終投与日に、アレルギー物質を腹腔内に投与した後に採血し、血清中のヒスタミン量を測定した。

C)光合成細菌RAP99菌体投与あり

雌性マウス19匹を用いた。各マウスに、光合成細菌RAP99菌体試料溶液10 mg/kgを、1日1回、2週間経口投与した。最終投与日に、アレルギー物質を腹腔内に投与した後に採血し、血清中のヒスタミン量を測定した。

ヒスタミンとは

図1.マウス血清中のヒスタミン量

身体全体に分布しており、アレルギーやアナフィラキシー症状にも深く関係している物質。

ヒスタミンが体内で過剰になるとアレルギーを起こすと考えられており、かゆみや痛みの原因ともいわれる。

結果・考察

図1の結果から光合成細菌RAP99菌体投与無群は6.6μM、光合成細菌RAP99菌体投与有群では4.2μMであったため、光合成細菌RAP99投与群は投与無群と比較して36%のヒスタミン量を抑制している事がわかった。

従って光合成細菌RAP99菌体試料の経口投与によって体内でアレルギー反応を引き起こす物質のひとつであるヒスタミンの発現が抑制されることが確認された。

【試験責任者:東北薬科大学(現:東北医科薬科大学)教授 石川正明】

ミクログリア細胞(C8-B4)のアミロイドβペプチドの貪食亢進効果の評価試験

アミロイドβとは

アミロイドβは脳内で作られるタンパク質の一種で、アルツハイマー病の発症に大きく関わっていると考えられている。

健康な人の脳にも存在し、通常は分解され排出される。しかし、正常なアミロイドβよりも大きなタンパク質は排出されずに蓄積してしまい、蓄積したアミロイドβは脳細胞を死滅させると考えられている。

アミロイドβの蓄積は、アルツハイマー病を発症する10年以上も前から溜まり始めていると言われている。その原因はまだ完全には解明されていないが、加齢などによる分解や排出機能の衰えが原因の1つといわれている。

ミクログリア細胞とは

血液中の白血球は、病気から身体を守る免疫系の代表的な細胞といわれている。

しかし、脳には白血球が入らないようになっており、その代わりに脳の免疫系を担っているのが、ミクログリア細胞である。

このミクログリア細胞が貪食※1によりアミロイドβを処理し、除去することが分かっている。アルツハイマー病の改善には、ミクログリア細胞によるアミロイドβの貪食活性を高めることが求められている。

(※1:貪食とは、体内の細胞が不必要なものを消化・分解する作用のこと。)

本試験の目的

光合成細菌RAP99熱水抽出物と、RAP99由来LPS(以下RAP99-LPS)における、ミクログリア細胞のアミロイドβペプチドの貪食活性効果を明らかにする。

試験方法

マウスのミクログリア細胞にRAP99熱水抽出物およびRAP99-LPSを加え、培養した。

そこへヒトのアミロイドβを含有する液を添加し、さらに培養した。培養後の各試料のアミロイドβ貪食率を測定した。

陰性対照物質※2は培養液、陽性対照物質※3は大腸菌由来のモノホスホリルリピドA(以下、MPLAと表記)を用いた。

(※2、3:陰性対照物質とは試験に対して効果がないことが分かっている物質、陽性対照物質とは期待される効果があることが分かっている既知の物質のこと。)

試験結果・考察

表1、図1に各被験物質におけるアミロイドβ貪食率を示す。

表1 各被験物質におけるアミロイドβ貪食率

図1 各被験物質におけるアミロイドβ貪食率

上記の結果より、RAP99熱水抽出物では、用量依存的な貪食率の上昇が認められた。10μg/mL、100μg/mLにおいては有意に高い値を示した。RAP99-LPSでは、いずれの用量においても有意に高い貪食率が認められた。

以上の結果より、RAP99熱水抽出物およびRAP99-LPSは、ミクログリア細胞に働き、アミロイドβの貪食活性を高める効果を示すことが明らかになった。

アルツハイマー病の原因の一つとして、アミロイドβの増加が挙げられているため、RAP99熱水抽出物およびRAP99-LPSを摂取することで、アルツハイマー病の予防に繋がる可能性があると考えられる。

【試験責任者:自然免疫応用技研株式会社】

マウスのマクロファージ細胞由来のRAW263.7細胞に対するNF-κB抑制試験の評価試験

マクロファージとは

マクロファージイメージ

マクロファージは白血球の一種で、免疫系において重要な役割を担っている。

体内に侵入した細菌などを食べ、消化・排出し、細菌感染を防ぐ働きをしている。

NF-κBとは

ヒトの体内にウイルスや細菌が侵入すると、免疫細胞が炎症反応という一連の免疫反応を起こし、侵入した病原体を攻撃する。

ところが、この炎症反応が何らかの原因で暴走してしまうと、アレルギー疾患や自己免疫疾患となることが知られている。生体は免疫系を活性化するだけではなく、抑制する働きもあり、炎症反応が過剰にならないよう調節している。

炎症反応を起こすには、NF-κBという転写因子※1の活性化が重要となる。NF-κBは炎症反応に必要な様々な遺伝子を活性化させ、炎症反応を誘導させる。

したがって、NF-κBの活性化を抑制することで、アレルギー疾患や自己免疫疾患の治療に繋がる可能性がある。

(※1:転写因子とは、DNAに結合するタンパク質のことで、遺伝子を調節する働きをしている)

試験の目的

光合成細菌RAP99菌体(以下RAP99)およびRAP99由来LPS(以下RAP99-LPS)のNF-κB活性化抑制効果により、抗炎症作用について考察する。

試験結果

マウスのマクロファージ細胞にRAP99およびRAP99-LPSを加えて培養し、吸光光度法によりNF-κBを測定した。

また、陽性対照物質※2として、小麦やサツマイモなどの植物と共生している細菌より精製したLPS(以下、LPSp)を用いて同様にNF-κBを測定した。

(※2:陽性対照物質とは、期待される効果があることが分かっている既知の物質のこと)

 

NF-κB測定結果を図1、表1に示す。

図1.RAP99-LPSおよびRAP99熱水抽出物によるマウスマクロファージ細胞中のNF-κB測定結果

表1.RAP99-LPSおよびRAP99熱水抽出物によるマウスマクロファージ細胞中のNF-κB測定結果

上記の結果、RAP99-LPSでは用量依存的な低下が有意に認められた。また、RAP99熱水抽出物では3000ng/mLにおいて、有意に低い値を示した。

よって、RAP99-LPSおよびRAP99熱水抽出物は、NF-κBの活性化を抑制する働きがあると考えられる。

したがって、これらを摂取することで、アレルギー疾患や自己免疫疾患の治療につながる可能性があると考えられる。

【試験責任者:自然免疫応用技研株式会社】

炎症性サイトカインに対する効果の評価試験

炎症性サイトカインとは?

サイトカインとは、主に白血球や免疫細胞から産生・分泌されるタンパク質のことで、私たちの身体を異物から守るために重要なものである。サイトカインは、『炎症性サイトカイン』と『抗炎症性サイトカイン』があり、前者は炎症を促進する方向へ働き、後者は逆に炎症を抑える方向に働く。これら2つのサイトカインのバランスが崩れると自己免疫疾患などの病気を引き起こすことが知られている。

試験の目的

光合成細菌RAP99およびRAP99由来LPS(以下、RAP99-LPS)の抗炎症作用について、一酸化窒素(NO)とTNF-αを指標として調べることを目的とする。NOやTNF-αの産生量が多いと炎症作用を引き起こす原因となる。

試験方法

試験の流れを図1に示す。RAW264.7細胞を、試験液で24時間前処理した後で培地を除いた。その後、無添加の培地、もしくはLPSp※を添加した培地を加えて、さらに24時間培養を行い、培地中のNO産生量およびTNF量を測定した。これにより、RAW264.7細胞をRAP99で予め処理した後のLPSpによる炎症誘導能への影響を確認することができる。
※陽性対照として、グラム陰性菌の一種で小麦やサツマイモなどの植物の共生菌として知られるパントエア・アグロメランス(Pantoea agglomerans)より精製したLPS(以下LPSpと略記)を使用した。

図1 試験の流れ

【試験結果】
(1)NO産生結果

 

図2 LPSp(陽性対照群)処理群でのNO産生量

 

図3 RAP99-LPS処理群でのNO産生量

RAP99-LPS では0.01ng/mL~10ng/mLまでの範囲におけるNO2-産生量は、陽性対照群とほぼ同様な傾向を示した。しかし、10ng/mL~10µg/mLの範囲では、陽性対照と同様な用量依存的なNO2-産生量の上昇は認められず、著明な産生抑制傾向が認められた。よって、RAP99-LPSでは高いNO2-産生量抑制効果を示すことが認められた。

(2)TNF-α産生結果

 

図4 LPSp処理群のTNF-α産生量

図5 RAP99-LPS処理群のTNF-α産生量

RAP99-LPSでは、10ng/ml以上でTNF-αの産生を用量依存的に有意に抑える結果となった。また、LPSpに対しRAP99-LPSは、TNF-αの産生を低下させ始める用量が高い(抗炎症効果が現れる用量が高い)ことが示唆された。
また、0ng/mLのときの産生量と比較すると、LPSpにおいては100ng/mLにおいて最大40%程度までの抑制が認められたが、RAP99-LPSでは10000ng/mLにおいて10%程度まで抑制しており、より高いTNF-α産生量抑制効果が示唆された。

結果まとめ

以上の結果から、RAP99-LPSはNO2-およびTNF-αの産生量抑制効果があると認められた。よって、光合成細菌RAP99-LPSは炎症性サイトカインの産生を抑制する効果があると考えられる。

【試験責任者:自然免疫応用技研株式会社】